1.Beurteilende(r)| Name: | Margit Sara |
| Herkunftsbetrieb: | |
| Arbeit |
| Typ der Arbeit: | Dissertation |
| Sprache der Arbeit: | Deutsch |
| Titel der Arbeit in Originalsprache: | Charakterisierung und Applikation mit S- Schichten belegter Liposomen zur Bindung von biologisch aktiven Molekülen |
| Titel der Arbeit in deutsch: | Charakterisierung und Applikation mit S- Schichten belegter Liposomen zur Bindung von biologisch aktiven Molekülen |
| Titel der Arbeit in englisch: | n.a. |
| Publikationsmonat: | 12.1998 |
| Seitenanzahl: | |
| Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur |
| AC-Nummer: | AC02491956 |
| Abstract |
| Abstract in Deutsch: | Die Rekristallisation isolierter Untereinheiten des S-Schichtproteins von
Bacillus stearothermophilus PV72/p2 an positiv geladene, unilamellare Lipo-
somen aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Cholesterin und Hexadecyl-
amin (HDA) im molaren Verhältnis 10 : 5 : 4 wurde optimiert. Die Charakter-
isierung dieser mit S-Schicht belegten Liposomen zeigte, daß das S-Schicht-
protein zu DPPC-Verhältnis von 5.7 nmol / ¿mol etwa dem aus dem Flächenbe-
darf von S-Schichtgitter und Lipidmembran theoretisch berechneten Wert ent-
spricht. Weiters ergab die Rekristallisation des S-Schichtproteins an die
positiv geladenen Liposomen eine Umkehr des Zeta-Potentials von + 29 mV zu
- 27 mV. Eine kovalente Quervernetzung des rekristallisierten S-Schichtpro-
teins konnte durch Glutaraldehyd erreicht werden, wobei auch nahezu alle
(> 95 %) Aminogruppen des in der Liposomenmembran enthaltenen HDAs betei-
ligt waren. Der Einfluß des S-Schichtgitters auf die Stabilitätseigenscha-
ften der Liposomen wurde an Hand der Freisetzung des eingeschlossenen hy-
drophilen Markers Carboxyfluorescein (CF) in Folge mechanischer oder ther-
mischer Beanspruchung untersucht. Dabei wurde unter Scher- bzw. Ultrasch-
allbeanspuchung aus S-Schicht belegten Liposomen nur etwa halb soviel CF
freigesetzt wie aus unbelegten. Auch wiederholte Temperaturwechsel von
25°C auf 55°C und zurück lösten im Vergleich zu unbelegten Liposomen bei
S-Schicht belegten beträchtlich weniger CF Freisetzung aus, was ebenso nach
einer Behandlung der entsprechenden Präparate mit Glutaraldehyd zu beobach-
ten war.
Weiters konnte das S-Schichtgitter auf den Liposomen als Matrix zur defin-
ierten Bindung biologisch aktiver Makromoleküle über das Avidin-Biotinsys-
tem genutzt werden. Für biologische Anwendungen von S-Schicht belegten Lip-
osomen waren Reagentien zur kovalenten Quervernetzung des S-Schichtproteins
bzw. zur Modifikation seiner funktionellen Gruppen zu finden, die nicht in
das Innere der Vesikel eindringen konnten. Sowohl ein durch Perjodatspalt-
ung von Raffinose erhaltener Dialdehyd als auch eine mittels Sulfosuccin-
imid aktivierte C8-Dicarbonsäure erwiesen sich als membranimpermeabel und
geeignet das S-Schichtgitter unter Aufrechterhaltung der strukturellen In-
tegrität vollständig zu vernetzen. Durch Reaktion mit Diazobenzoylbiocyti-
din, das bevorzugt mit Histidin und Tyrosinseitenketten kuppelt, konnten in
das S-Schichtgitter auf den Liposomen 2 Biotinreste, die für eine weitere
Avidinbindung zugänglich waren, pro S-Schicht-Subeinheit eingeführt werden.
Über die eingeführten Biotinreste konnte eine geordnete, monomolekulare
Schicht von Streptavidin an der Oberfläche der Liposomen aufgebaut werden,
die in weiterer Folge eine definierte Bindung biotinylierter Moleküle er-
laubte, was an Hand von biotinyliertem Ferritin elektronenmikroskopisch
gezeigt werden konnte. Zur Bestätigung der Funktionalität wurde biotiny-
liertes anti-human IgG gebunden und die biologische Aktivität mittels
ELISA nachgewiesen.
|
| Abstract in Englisch: | Recrystallization of the crystalline cell surface layer (S-layer) protein
of Bacillus stearothermophilus PV72/p2 on unilamellar liposomes composed
of dipalmitoylphosphatidylcholine, cholesterol and hexadecylamine (HDA) in
a molar ratio of 10 : 5 : 4 was optimized. Their characterization revealed
that the S-layer protein to lipid ratio approximately corresponded to the
theoretical value and that coating resulted in inversion of their zeta-
potential. Covalent crosslinking of the recrystallized S-layer protein with
glutaraldehyde involved almost all amino groups from HDA in the liposomal
membrane. Comparative measurments of the hydrophilic marker release from
plain and S-layer-coated liposomes demonstrated that the S-layer lattice
on liposomes considerably increased their stability towards mechanical
(shear forces, ultrasonication) and thermal (temperature shifts) stress.
Furthermore, S-layer coated liposomes were established to act as matrix for
defined binding of functional molecules via the avidin-biotin system.
Complete crosslinking of the S-layer lattice without penetration through
the liposomal membrane was achieved with both a hydrophilic dialdehyde and
a sulfo-succinimide activated dicarboxylic acid. Independent on previous
crosslinking coupling of p-diazobenzoyl biocytin resulted in biotinylation
of S-layer-coated liposomes. Thus, an ordered monomolecular streptavidin
layer could be formed on their surface suitable for defined binding of
biotinylated molecules, like anti-human IgG for which the biological
activity was confirmed by ELISA. |
| Schlagworte |
| Schlagwörter Deutsch: | Mikrobiologie Bacillus stearothermophilus S-Schichten Liposomen |
| Schlagwörter Englisch: | BIOLOGY, MICROBIOLOGY Bacillus stearothermophilus liposomes S-layers |
| Sonstiges |
| Signatur: | D-8799 |
| Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H63000 Zentrum für Ultrastrukturforschung (ZUF) |
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