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AutorIn
Name:BSc Sarah Ablasser
Beurteilende*r
Name:Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.techn. Christoph Herwig
Herkunftsbetrieb:
Arbeit
Typ der Arbeit:Masterarbeit
Sprache der Arbeit:Deutsch
Titel der Arbeit in Originalsprache:Production and Characterization of recombinant Hyaluronidase Inclusion Bodies from Apis mellifera in E. coli Bl21(DE3)
Titel der Arbeit in deutsch:Production and Characterization of recombinant Hyaluronidase Inclusion Bodies from Apis mellifera E.coli Bl21(DE3)
Titel der Arbeit in englisch:Production and Characterization of recombinant Hyaluronidase Inclusion Bodies from Apis mellifera in E. coli Bl21(DE3)
Publikationsmonat:11.2020
Seitenanzahl:78
Volltext
Volltext der Arbeit:Volltext der Arbeit im PDF-Format laden
Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur
AC-Nummer:AC16129667
Abstract
Abstract in Deutsch:Escherichia coli ist ein Expressionswirt der Wahl für die Produktion rekombinanter Proteine. Die
Vorzüge sind schnelles Wachstum zu hohen Zelldichten auf kostengünstigen Medien und hohe
Expressionsausbeuten. In Kombination mit dem pET-Expressionssystem und IPTG als
Induktionsmittel können hohe Replikationsraten und Produktausbeuten erzielt werden. Die
Expression von komplexen rekombinanten Proteinen mit hohem Molekulargewicht und vielen
Disulfidbindungen führt jedoch häufig zur Bildung von Einschlusskörpern (Inclusion Bodies – IB).
Das Missverständnis, dass IBs aggregierte Proteine ohne biologische Aktivität sind, änderte sich
in den letzten Jahren, als man entdeckte, dass solche Einschlusskörper aufgrund einer teilweise
nativen Proteinstruktur eine Restaktivität aufweisen. Biologisch aktive IBs stellen wichtige
Werkzeuge für direkte Anwendungen in vielen biotechnologischen Bereichen dar, insbesondere in
der Biomedizin.
Das Ziel dieser Studie war es, ausgehend von einem Experimentaldesign (design of experiments –
DoE) rekombinante Hyaluronidase von Apis mellifera in E. coli BL21(DE3) als IB zu exprimieren
und darüber hinaus die biologische Aktivität zu bestimmen. Aufgrund der hohen metabolischen
Belastung, welche die Produktion des Proteins auf die Zellen ausübt, ist die Hyaluronidase für E.
coli schwer zu exprimieren, was zu niedrigen Expressionsausbeuten führte. Die besten
Bedingungen zur Erzielung hoher spezifischer Titer wurden bei einer Temperatur von 25 °C und
einer spezifischen Substratzufuhrrate von 0,1 g/g/h nach zwei - vier Stunden Induktion gefunden.
Die Aktivität der Hyaluronidase-IBs wurde mittels FT-IR-Spektroskopie verifiziert. Das
Fortschreiten des enzymatischen Abbaus des Substrats Hyaluronan wurde über die Zeit gemessen.
Wir beobachteten, dass der Abbau von Hyaluronan bei gleichbleibender Konzentration mit höheren
Hyaluronidase-IB-Konzentrationen zunahm. Darüber hinaus können aktive IBs direkt für den
Abbau von Hyaluronan verwendet werden, wodurch sich weitere DSP-Schritte erübrigen.
Aufgrund der Ergebnisse sind wir überzeugt, dass weitere IR-Analysen den Weg für die
Aktivitätscharakterisierung von IBs und Enzymen in situ ebnen werden.
Abstract in Englisch:Being an expression host of choice for the production of recombinant proteins, Escherichia coli
accounts for fast growth to high cell densities on inexpensive media and high expression yields. In
combination with the pET expression system and IPTG as inducing agent, high replication rates
and product yields can be achieved. However, the expression of complex recombinant proteins
with high molecular weight and many disulfide bonds often results in the formation of Inclusion
Bodies.
The misconception of Inclusion Bodies being aggregated proteins without biological activity
changed in recent years when it was discovered that such Inclusion Bodies exhibit residual activity
due to a native-like protein structure. Being biologically active, Inclusion Bodies are important
tools for direct applications in many biotechnological fields, especially in biomedicine.
The goal of this study was to express recombinant hyaluronidase of Apis mellifera in E. coli
BL21(DE3) as Inclusion Bodies using a DoE approach and furthermore, to determine the biological
activity. Indicated by a high metabolic burden to the cells, hyaluronidase is hard to express for E.
coli, which resulted in low expression yields. The best conditions to obtain high specific titers were
found at a temperature of 25 °C and a specific substrate feeding rate of 0.1 g/g/h after two – four
hours of induction.
The activity of hyaluronidase IBs was verified using FT-IR spectroscopy. The progression of the
enzymatic degradation of the substrate hyaluronan was measured over time. We observed that the
degradation of hyaluronan at same concentrations increased at higher hyaluronidase IB
concentrations. Moreover, active IBs can be directly used for the degradation of hyaluronan, thus
eliminating the need for further DSP steps.
Based on the results, we believe that further IR analyses will pave the way for activity
characterization of Inclusion Bodies and enzymes in situ.
Schlagworte
Schlagwörter Deutsch: Escherichia coli; active inclusion body; recombinant protein production; upstream process development; FT-IR spectroscopy
Schlagwörter Englisch:
Sonstiges
Signatur:D-22077
Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird:H79100 Institut für Bioverfahrenstechnik


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