Beurteilende*rName: | Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.techn. Christoph Herwig |
Herkunftsbetrieb: | |
Arbeit |
Typ der Arbeit: | Masterarbeit |
Sprache der Arbeit: | Deutsch |
Titel der Arbeit in Originalsprache: | Production and Characterization of recombinant Hyaluronidase Inclusion Bodies from Apis mellifera in E. coli Bl21(DE3) |
Titel der Arbeit in deutsch: | Production and Characterization of recombinant Hyaluronidase Inclusion Bodies from Apis mellifera E.coli Bl21(DE3) |
Titel der Arbeit in englisch: | Production and Characterization of recombinant Hyaluronidase Inclusion Bodies from Apis mellifera in E. coli Bl21(DE3) |
Publikationsmonat: | 11.2020 |
Seitenanzahl: | 78 |
Volltext |
Volltext der Arbeit: | Volltext der Arbeit im PDF-Format laden |
Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur |
AC-Nummer: | AC16129667 |
Abstract |
Abstract in Deutsch: | Escherichia coli ist ein Expressionswirt der Wahl für die Produktion rekombinanter Proteine. Die Vorzüge sind schnelles Wachstum zu hohen Zelldichten auf kostengünstigen Medien und hohe Expressionsausbeuten. In Kombination mit dem pET-Expressionssystem und IPTG als Induktionsmittel können hohe Replikationsraten und Produktausbeuten erzielt werden. Die Expression von komplexen rekombinanten Proteinen mit hohem Molekulargewicht und vielen Disulfidbindungen führt jedoch häufig zur Bildung von Einschlusskörpern (Inclusion Bodies – IB). Das Missverständnis, dass IBs aggregierte Proteine ohne biologische Aktivität sind, änderte sich in den letzten Jahren, als man entdeckte, dass solche Einschlusskörper aufgrund einer teilweise nativen Proteinstruktur eine Restaktivität aufweisen. Biologisch aktive IBs stellen wichtige Werkzeuge für direkte Anwendungen in vielen biotechnologischen Bereichen dar, insbesondere in der Biomedizin. Das Ziel dieser Studie war es, ausgehend von einem Experimentaldesign (design of experiments – DoE) rekombinante Hyaluronidase von Apis mellifera in E. coli BL21(DE3) als IB zu exprimieren und darüber hinaus die biologische Aktivität zu bestimmen. Aufgrund der hohen metabolischen Belastung, welche die Produktion des Proteins auf die Zellen ausübt, ist die Hyaluronidase für E. coli schwer zu exprimieren, was zu niedrigen Expressionsausbeuten führte. Die besten Bedingungen zur Erzielung hoher spezifischer Titer wurden bei einer Temperatur von 25 °C und einer spezifischen Substratzufuhrrate von 0,1 g/g/h nach zwei - vier Stunden Induktion gefunden. Die Aktivität der Hyaluronidase-IBs wurde mittels FT-IR-Spektroskopie verifiziert. Das Fortschreiten des enzymatischen Abbaus des Substrats Hyaluronan wurde über die Zeit gemessen. Wir beobachteten, dass der Abbau von Hyaluronan bei gleichbleibender Konzentration mit höheren Hyaluronidase-IB-Konzentrationen zunahm. Darüber hinaus können aktive IBs direkt für den Abbau von Hyaluronan verwendet werden, wodurch sich weitere DSP-Schritte erübrigen. Aufgrund der Ergebnisse sind wir überzeugt, dass weitere IR-Analysen den Weg für die Aktivitätscharakterisierung von IBs und Enzymen in situ ebnen werden. |
Abstract in Englisch: | Being an expression host of choice for the production of recombinant proteins, Escherichia coli accounts for fast growth to high cell densities on inexpensive media and high expression yields. In combination with the pET expression system and IPTG as inducing agent, high replication rates and product yields can be achieved. However, the expression of complex recombinant proteins with high molecular weight and many disulfide bonds often results in the formation of Inclusion Bodies. The misconception of Inclusion Bodies being aggregated proteins without biological activity changed in recent years when it was discovered that such Inclusion Bodies exhibit residual activity due to a native-like protein structure. Being biologically active, Inclusion Bodies are important tools for direct applications in many biotechnological fields, especially in biomedicine. The goal of this study was to express recombinant hyaluronidase of Apis mellifera in E. coli BL21(DE3) as Inclusion Bodies using a DoE approach and furthermore, to determine the biological activity. Indicated by a high metabolic burden to the cells, hyaluronidase is hard to express for E. coli, which resulted in low expression yields. The best conditions to obtain high specific titers were found at a temperature of 25 °C and a specific substrate feeding rate of 0.1 g/g/h after two – four hours of induction. The activity of hyaluronidase IBs was verified using FT-IR spectroscopy. The progression of the enzymatic degradation of the substrate hyaluronan was measured over time. We observed that the degradation of hyaluronan at same concentrations increased at higher hyaluronidase IB concentrations. Moreover, active IBs can be directly used for the degradation of hyaluronan, thus eliminating the need for further DSP steps. Based on the results, we believe that further IR analyses will pave the way for activity characterization of Inclusion Bodies and enzymes in situ. |
Schlagworte |
Schlagwörter Deutsch: | Escherichia coli; active inclusion body; recombinant protein production; upstream process development; FT-IR spectroscopy |
Schlagwörter Englisch: | |
Sonstiges |
Signatur: | D-22077 |
Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H79100 Institut für Bioverfahrenstechnik |