Beurteilende(r)| Name: | Dr. Otto-Wilhelm Merten |
| Herkunftsbetrieb: | |
| Arbeit |
| Typ der Arbeit: | Masterarbeit |
| Sprache der Arbeit: | Englisch |
| Titel der Arbeit in Originalsprache: | ^Development of a rAAV production system using stable producer cell lines based on recombinant HeLa cell cultures and evaluation of an electronic nose for the control of bioreactor cultures |
| Titel der Arbeit in deutsch: | n.a. |
| Titel der Arbeit in englisch: | Development of a rAAV production system using stable producer cell lines based on recombinant HeLa cell cultures and evaluation of an electronic nose for the control of bioreactor cultures. |
| Publikationsmonat: | 03.2003 |
| Seitenanzahl: | |
| Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur |
| AC-Nummer: | AC03687788 |
| Abstract |
| Abstract in Deutsch: | Virale Vektoren stellen die gängigste Methode des Gentransfers dar. Wegen einer Reihe von Vorteilen kommt in letzter Zeit besonders der rekombinante adeno-assoziierte virale Vektor (rAAV) für gentherapeutische Behandlungen vermehrt zur Anwendung. In diesem Projekt wurde zur Herstellung von rAAV zwei Produzenten Zell-Linien, die von HeLa Zellen abstammen, verwendet. Diese rekominanten Zellen beinhalten 2 verschiedene DNA-Sequenzen, die für die Produktion von rAAV wichtig sing: die AAV-gene (rep-cap) und den zu produzierenden rAAV-Vektor (ITR-Transgen-ITR). Eine Infektion dieser Zellen mit einem Helfervirus (z.B. Adenovirus) führt zur Replikation dieses Helferviruses und zur Mobilisierung und damit Produktion von rAAV. Die Produktionsraten von rAAV wurden zuerst in Petri Schalen, in Spinner-Flaschen und zuletzt im Bioreaktor, welcher mit einer BioNose verbunden war, bestimmt. Die optimalen Kultivierungsbedingungen, welche in Petri-Schalen bestimmt wurden, wurden auf Microcarrier Kulturen sowie in Suspensionskulturen in Spinner-Flaschen übertragen. Es stellte sich dabei heraus, dass, trotz der Bildung von großen Zellhaufen, Suspensionskulturen besser produzierten. Die Zugabe von Dextran Sulfat zum Medium erwies sich als effektivste Maßnahme zur Verhinderung der Zellaggregation und war von einer Steigerung der rAAV Produktion begleitet. Es konnte gezeigt werden, dass unter diesen Bedingungen der optimale Infektionszeitpunkt 48 Stunden nach Inokulation, bei einer ausgesäten Zelldichte von 4x105 Zellen/ml beträgt. Während der Bioreaktor-Versuche neigten die Zellen zum adhärenten Wachstum am Reaktorboden oder blieben als Einzel-Zellen in Suspension. Jedoch war hier die Viabilität stets geringer als in den Spinnerkulturen. Dies könnte durch die veränderten Bedingungen bezüglich Rührung (Impeller und Cell-lift) und/oder der Belüftung begründet sein. Die BioNose wurde mit den Zell-Linien TeFly GA18 als Referenzzelllinie and ROS26 Z9 angewendet. Nur die MOS-Sensoren und der CO2-Sensor gaben interpretierbare Signale mit der Zell-Linie TeFly GA18. Die MOS-Sensoren spiegelten die zelluläre Wachstumskurve wider, die Responskinetiken waren aber völlig unterschiedlich zu einem Versuch mit einer bakteriellen Kontamination. In ROS26 Z9 Kulturen konnte die Bionose nur das der Infektion mit Adenovirus entsprechende Signal detektieren. |
| Abstract in Englisch: | For gene therapy, viral vectors present the most promising tools, in particular, recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) are more and more applied. During this study we used stable producer cell lines, ROS26 Z1 and Z9, derived from recombinant HeLa cells. These recombinant cells contain 2 different gene sequences, which are important for the production of rAAV: the AAV-genes (rep-cap) and the rAAV vector (ITR-transgene-ITR) which should be produced. The infection of these cells with a helper virus (e.g. adenovirus) leads to the replication of this helper virus and the mobilisation and thus production of rAAV. The cell growth and viral vector production kinetics of these cell lines were examined at a small scale (Petri dishes), in spinner flasks, and finally in a bioreactor which was connected to an electronic nose for process monitoring. The conditions for obtaining the highest rAAV yields in Petri dishes were transferred to spinner flasks for microcarrier and suspension cultures. The best results were obtained when cells were grown in suspension, despite the formation of big cell aggregates. The addition of dextran sulphate showed the most promising results due to avoidance of cell aggregation and increased vector production. The optimal infection time was shown to be 48 hours after seeding at a density of 4x105 cells/ml. In bioreactor cultures the cells stayed in suspension as single cells or grew adherently at the reactor bottom. The viability of these cells was low, probably due to higher shearing forces in the reactor because of different agitation systems (impeller and cell lift) in comparison to spinner flasks and/or the additional aeration. The BioNose was used with the cell lines TeFly GA18 (as reference) and ROS26 Z9. Only the MOS- sensors and the CO2-sensor gave interpretable signals with the cell line TeFly GA18. The MOS-sensor responses corresponded to the cellular growth. However, they were completely different when compared with a bacterial contamination experiment. During cultivations of ROS26 Z9 the BioNose gave only a reproducible signal corresponding response to the infection of the culture with helper virus. |
| Schlagworte |
| Schlagwörter Deutsch: | Mikrobiologie Tierische Zellkultur Virologie Gentherapie |
| Schlagwörter Englisch: | BIOLOGY, MICROBIOLOGY Virology Animal cell culture Genetherapy |
| Sonstiges |
| Signatur: | D-11145 |
| Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H62000 Inst.f. Angewandte Mikrobiologie (IAM) |
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