| AutorIn | | Name: | MAG. Rene Novotny | 1.Beurteilende(r)| Name: | Ao.Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Paul Messner | | Herkunftsbetrieb: | | | Arbeit | | Typ der Arbeit: | Dissertation | | Sprache der Arbeit: | Englisch | | Titel der Arbeit in Originalsprache: | Genetic characterization of the Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a S-layer glycan biosynthesis (slg) gene cluster | | Titel der Arbeit in deutsch: | n.a. | | Titel der Arbeit in englisch: | Genetic characterization of the Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a S-layer glycan biosynthesis (slg) gene cluster | | Publikationsmonat: | 03.2004 | | Seitenanzahl: | | | Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur | | AC-Nummer: | AC04059519 | | Abstract | | Abstract in Deutsch: | Posttranslationale Modifikation von Proteinen schien bis vor kurzem den höheren Organismen vorbehalten zu sein. Vor einiger Zeit wurden aber glykosylierte Proteine auch in Bakterien gefunden. Zu den am besten untersuchten bakteriellen Glykoproteinen zählen glykosylierte S-Schichtproteine. S-Schichten stellen die äußerste Zellgrenzfläche bei vielen Eubakterien und Archaebakterien dar und bestehen aus identen Protein- oder Glykoproteinuntereinheiten, welche die Zelloberfläche während aller Wachstums- und Teilungsphasen vollständig bedecken. Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a, ein thermophiles, Gram-positives Bakterium, besitzt ein glykosyliertes S-Schichtprotein (SgsE), dessen Glykankette aus Polyrhamnan-Wiederholungseinheiten besteht und über einen beta-D-Galaktoserest kovalent an das S-Schichtprotein gebunden ist. Zur Aufklärung des Mechanismus der S-Schichtglykan Biosynthese wurde der gesamte S-Schichtglykan Biosynthesecluster (slg-Biosynthesecluster) sequenziert und die Funktion der einzelnen Leserahmen im Datenbankvergleich analysiert. Durch Ähnlichkeiten der Genprodukte des slg-Biosyntheseclusters zu Proteinen, welche in der LPS O-Antigen Biosynthese von Gram-negativen Bakterien mitwirken, konnte ein mögliches Modell für die S-Schichtglykan Biosynthese aufgestellt werden, dessen experimenteller Beweis zur Zeit erfolgt. Untersuchungen zur Regulation der S-Schichtglykan Biosynthese zeigten, dass das S-Schichtgen monocistronisch transkribiert wird, während der gesamte slg-Biosyntheseclusters als eine Transkriptionseinheit (polycistronisch) synthetisiert wird. In der Folge wurde der Einfluss der Anzuchttemperatur auf die S-Schichtglykosylierung untersucht, wobei aber keine Änderung im Glykosylierungsverhalten bei erhöhter Temperatur festgestellt werden konnte. Mittels Northern Blot Analyse konnte aber gezeigt werden, dass sgsE bei erhöhter Temperatur (67 °C) im Gegensatz zur normalen Wachstumstemperatur von G. stearothermophilus NRS 2004/3a (57 °C) stark transkribiert wird. Desweiteren wurden die Promoterregionen des S-Schichtgens und des slg-Biosyntheseclusters mittels 5¿ RACE bestimmt. Für das S-Schichtgen wurden zwei Promotoren gefunden, die nacheinander angeordnet sind und die jeweils von einer Palindromsequenz gefolgt werden. Palindromsequenzen wurden bereits im Zusammenhang mit der Stress-induzierten Transkription von Genen diskutiert. Gegenwärtig ist es nicht möglich, G. stearothermophilus NRS 2004/3a zu transformieren und somit durch gezieltes Ausschalten von spezifischen Genen des slg-Biosyntheseclusters und anschließender Wiederherstellung der Proteinfunktion mit Hilfe eines rekombinanten Proteins die Funktionalität der entsprechenden Proteine zu bestimmen. Zur Aufklärung der Funktionalität der einzelnen Genprodukte des slg-Biosyntheseclusters wurden diese Proteine in E. coli überexprimiert. Die erhaltenen Proteine zeigten in den meisten Fällen eine Verkürzung in der Aminosäuresequenz. Da die Mehrzahl der im slg-Biosyntheseclusters dieses Bakteriums codierten Proteine Membran-gebunden vorkommen, scheint es wahrscheinlich, dass es aufgrund der Anhäufung von hydrophoben Aminosäuren in der Transmembranregion zu einer sterischen Hinderung der Proteinsynthese in E. coli kommt, die in einer Verkürzung des Proteins resultiert. Da die katalytischen Zentren der jeweiligen Proteine aber außerhalb der Transmembranregionen liegen, sollten die überexprimierten Proteine trotzdem funktionell sein; dies wird gegenwärtig getestet. Weiters wird an einem E. coli-Expressionsvektor gearbeitet, mit dem das gewünschte Gen unter der Kontrolle des Temperatur-induzierbaren sgsE Promoters überexprimiert werden kann. Zusätzlich wurden Vektoren für die Überexpression von Genen in Gram-positiven Lactobacillus-Stämmen hergestellt, indem induzierbare (nisA) und nicht-induzierbare (apf1 und slpA) Promotoren in den Vektor pNZ124Sph kloniert wurden. In der Folge wurden das S-Schichtgen sgsE und rmlA (kodiert für die Glukose-1-phosphat Thymidyltransferase, dem ersten Enzym in der Biosynthese des nukleotid-aktivierten Zuckers dTDP-L-Rha) in pNZ124Sph-PnisA kloniert und in Lactococcus lactis durch Induktion mit Nisin überexprimiert. Zur Zeit erfolgt die funktionelle Charakterisierung dieser Proteine.
| | Abstract in Englisch: | Protein glycosylation is a very common and most important post-translational modification process in living organisms. Previously, glycoproteins have been thought to be unique to eukaryotic cells, but nowadays the existence of prokaryotic glycoproteins is firmly established. In the course of studying post-translational modification of proteins by glycosylation, S-layer glycoproteins have become one of the best-studied prokaryotic glycoproteins. S-layers are regular, crystalline monolayers composed of identical protein or glycoprotein subunits, which completely cover prokaryotic cells. G. stearothermophilus NRS 2004/3a, a thermophile Gram-positive bacterium possesses a glycosylated S-layer protein and the complete structure of the S-layer glycan chains has been elucidated recently. In order to understand the mechanisms of S-layer glycosylation, the putative gene cluster responsible for S-layer glycan biosynthesis (slg gene cluster) has been sequenced and the genes have been assigned by protein database comparison. The slg gene cluster is located in close vicinity to the S-layer structural gene sgsE and codes for the dTDP-L-rhamnose biosynthesis (rml operon), required for building-up the polyrhamnan S-layer glycan, as well as for proteins involved in the assembly and export of the elongated glycan chain, and its subsequent transfer to the S-layer protein. Transcriptional analysis of sgsE and the slg gene cluster revealed that the S-layer structural gene sgsE is transcribed monocistronically, while the complete slg gene cluster is transcribed as a polycistronic transcriptional unit and independently of its target gene sgsE. In order to understand the regulatory mechanisms underlying the glycosylation process, the influence of temperature on non-glycosylated and glycosylated S-layer proteins from different G. stearothermophilus strains has been investigated. No effect of elevated temperature was observed at the S-layer protein level and the glycosylation behaviour of the G. stearothermophilus strains. Nevertheless, at elevated temperature enhanced transcription of sgsE was observed, indicating the involvement of a heat or stress element in the regulation of S-layer expression in G. stearothermophilus NRS 2004/3a. Using 5¿ RACE, two tandemly arranged putative promoter regions could be identified upstream of sgsE. Two inverted repeat sequences are located between the promoter regions and the sgsE gene, each of them is followed by an inverted repeat sequence. The regulatory role of inverted repeats has been discussed in heat shock response and supports the assumption, that S-layer protein transcription is regulated in a temperature-dependent way. Attempts to construct vectors for controlled overexpression of genes under the temperature-inducible sgsE promoter are in progress. In order to understand the catalytic function of the gene products of the slg gene cluster, selected proteins were overexpressed in E. coli. Most of the recombinant proteins were expressed in a truncated form. The majority of the proteins encoded by the slg gene cluster has been predicted to be transmembrane-spanning and membrane-anchored proteins, respectively, and truncation might therefore result from accumulation of hydrophobic amino acids found in the transmembrane-spanning region. As the catalytic domain of the proteins is located outside of the transmembrane region, the truncated proteins should be functional. Currently, assays to determine the protein activity are in progress. Additionally, expression vectors carrying the inducible nisA promoter of Lactococcus lactis and the non-inducible apf1 promoter of Lactobacillus johnsonii have been constructed for overexpression in various Gram-positive lactic acid bacteria.
| | Schlagworte | | Schlagwörter Deutsch: | Genetik S-Schicht Glykoproteine Gentechnologie Vakzine | | Schlagwörter Englisch: | CHEMISTRY, BIOCHEMISTRY Proteomics Genetic engineering S-layer protein glycosylation vaccines | | Sonstiges | | Signatur: | HB: D-11646 | | Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H80100 keine Angabe | |
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