| AutorIn | | Name: | DIPL.-ING.DR.NAT.TECHN. Oliver Spadiut | Beurteilende(r)| Name: | Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.techn. Dietmar Haltrich | | Herkunftsbetrieb: | | | Arbeit | | Typ der Arbeit: | Masterarbeit | | Sprache der Arbeit: | Englisch | | Titel der Arbeit in Originalsprache: | Modification of pyranose 2-oxidase from Trametes multicolor by different directed evolution methods | | Titel der Arbeit in deutsch: | n.a. | | Titel der Arbeit in englisch: | Modification of pyranose 2-oxidase from Trametes multicolor by different directed evolution methods | | Publikationsmonat: | 05.2005 | | Seitenanzahl: | | | Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur | | AC-Nummer: | AC04551363 | | Abstract | | Abstract in Deutsch: | Modification of pyranose 2-oxidase from Trametes multicolor by different directed evolution methods
Oliver Spadiut, Roland Ludwig, Montarop Yamabhai, Dietmar Haltrich
Division of Food Biotechnology, Department of Food Sciences and Technology, University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, A-1190 Vienna, Austria
School of Biotechnology, Institute of Agricultural Technology, Suranaree University of Technology, Nakhon Ratchasima 30000, Thailand
Abstract Pyranose Oxidasen (P2O) sind Pilzenzyme, die in Anwesenheit von Sauerstoff verschiedene Monosaccharide am Kohlenstoff C-2 oxidieren und somit die entsprechenden 2-Keto Zucker und Wasserstoffperoxid produzieren. Das bevorzugte Substrat on Pyranose Oxidasen ist D-Glukose, welche in das Zwischenprodukt 2-Keto-D-Glukose umgewandelt wird. 2-Keto-D-Glukose dient als Zwischenstufe in industriellen Prozessen, in welchen aus D-Glukose D-Fruktose hergestellt wird. Daher wurden Pyranose Oxidasen zu effizienten und attraktiven Werkzeugen in der Chemie der Kohlenhydrate. Wildtyp P2O zeigt jedoch nur geringe Aktivität mit Galaktose (Km of 9.2 mM, kcat of 3.1 sec-1). 2-Keto-D-galaktose ist ein Zwischenprodukt in der enzymatischen Synthese von Tagatose, welche als Zuckeraustauschstoff in der Lebensmittelindustrie verwendet wird, aber noch immer mittels einer chemischen Methode, die verschiedene Nachteile in sich birgt, produziert wird. Das Ziel unserer Arbeit war es, verschiedene Eigenschaften, besonders die Substratspezifität, der P2O unter der Verwendung verschiedener directed evolution Methoden, error prone PCR und DNA shuffling, und site-directed mutagenesis, zu verändern. Für unsere Forschungsarbeit verwendeten wir die rekombinante P2O aus dem Pilz Trametes multicolor, die in E.coli exprimiert wird (P2O-Gen auf dem pET21-vektor; RAmp, T7 promoter). Wir erstellten einen assay unter Verwendung von 96 well Platten, um Mutanten mit erhöhter katalytischer Aktivität mit Galactose detektieren zu können. Einzelne Mutanten wachsen in LB-Amp Medium und werden mit IPTG induziert. Nach Lyse der Zellen wird die P2O Aktivität durch die Bestimmung der produzierten Menge an Wasserstoffperoxid, welche durch eine kolorimetrische Reaktion, basierend auf ABTS und HRP, ermittelt wird, analysiert. Die resultierende färbige Reaktion wird in einem plate-reader, welcher das screening einer grossen Menge an Mutanten ermöglicht, bei OD540 gemessen. Unter Verwendung dieses assays wurde ein Mutant, pGOS17, mit erhöhter Aktivität mit Galactose (1,32 mal) gefunden. Für zukünftige screenings wird eine grössere Menge unterschiedlicher Mutanten, die mittels DNA shuffling kreiert werden, verwendet werden. Für diesen Zweck wurde eine Arbeitsvorschrift für das DNA shuffling der P2O erstellt. Mittels directed mutagenesis wurde des weiteren ein Mutant (pOS4), der keine katalytische Aktivität mit Glukose mehr besitzt, jedoch weiterhin mit IPTG induzierbar ist, erschaffen. Letztendlich planen wir eine rekombinante P2O mit erhöhter Aktivität mit Galaktose in lebensmitteltauglichen Lactobacilli zu exprimieren und folglich dieses Enzym für die enzymatische Synthese von Tagatose einzusetzen. | | Abstract in Englisch: | Modification of pyranose 2-oxidase from Trametes multicolor by different directed evolution methods
Oliver Spadiut, Roland Ludwig, Montarop Yamabhai, Dietmar Haltrich
Division of Food Biotechnology, Department of Food Sciences and Technology, University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, A-1190 Vienna, Austria
School of Biotechnology, Institute of Agricultural Technology, Suranaree University of Technology, Nakhon Ratchasima 30000, Thailand
Abstract Pyranose oxidases (P2O) are fungal enzymes which oxidize different monosaccharides at carbon-2 in the presence of oxygen to yield the corresponding 2-keto sugars and hydrogen peroxide. The preferred substrate of pyranose oxidases is D-glucose which is converted to 2-keto-D-glucose. This latter compound serves for example as an intermediate in proposed industrial processes for the conversion of D-glucose into D-fructose. As a consequence pyranose oxidases became efficient and attractive tools in carbohydrate chemistry. wtP2O, however, shows little activity with galactose (Km of 9.2 mM, kcat of 3.1 sec-1). 2-Keto-D-galactose is an intermediate in the enzymatic synthesis of tagatose, which is used as a sweetener in food industry but is still produced by a chemical method that shows several disadvantages. The aim of our work was to change various abilities, especially the substrate specificity, of P2O using different directed evolution methods, error prone PCR and DNA shuffling, and site-directed mutagenesis. For our research we used recombinant P2O from the fungus Trametes multicolor expressed in E. coli (P2O-gene on pET21-vector; RAmp, T7 promoter). We designed an assay to detect positive mutants showing increased activity with a desired sugar galactose using 96-well plates. Single mutants are grown in LB-Amp medium and then induced with IPTG. After lysis of the cells, P2O activity is analyzed by determining the produced amount of hydrogen peroxide using a colorimetric reaction based on ABTS and horseradish peroxidase. The resulting coloured reaction is measured in a plate-reader at OD540 which facilitates the screening of a large numbers of mutants. By using this approach one mutant, pGOS17, with increased activity with galactose (1.32 times) has been identified. A larger variety of mutant P2O will be subsequently obtained by DNA shuffling. To reach this aim, a protocol to shuffle P2O has been developed. Using directed mutagenesis a mutant, pOS4, which is enzymatically inactive with the substrate D-glucose, but still inducible by IPTG, has been created. Finally, we plan to express recP2O showing high activity with galactose in food approved lactobacilli and therefore can use the enzyme in a novel enzymatic process to produce tagatose.
| | Schlagworte | | Schlagwörter Deutsch: | Agronomie P2O Pyranose 2-Oxidase Galaktose Tagatose | | Schlagwörter Englisch: | AGRICULTURE, AGRONOMY P2O pyranose 2-oxidase galactose tagatose | | Sonstiges | | Signatur: | HB: D-12214 | | Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H75300 Abteilung Lebensmittelbiotechnologie (LBT) | |
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