Betreuer| Name: | Ao.Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Alois Jungbauer |
| Herkunftsbetrieb: | |
| 1.Beurteilende(r) |
| Name: | Ao.Univ.Prof. Ao.Univ.Prof. Mag.rer.nat. Dr.rer.nat. Christian Obinger |
| Herkunftsbetrieb: | |
| 2.Beurteilende(r) |
| Name: | Ao.Univ.Prof. Ao.Univ.Prof. Dr. Bernhard Auer |
| Herkunftsbetrieb: | |
| Arbeit |
| Typ der Arbeit: | Dissertation |
| Sprache der Arbeit: | Englisch |
| Titel der Arbeit in Originalsprache: | Engineering of protein adsorption: A biophysical study with focus on autoprotease fusion proteins |
| Titel der Arbeit in deutsch: | Ingenieurstechnische Aspekte der Proteinadsorption: Eine biophysikalische Studie mit Schwerpunkte auf Autoprotease-Fusionsproteine |
| Titel der Arbeit in englisch: | Engineering of protein adsorption: A biophysical study with focus on autoprotease fusion proteins |
| Publikationsmonat: | 09.2009 |
| Seitenanzahl: | 153 |
| Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur |
| AC-Nummer: | AC07452634 |
| Abstract |
| Abstract in Deutsch: | Diese Arbeit behandelt verschiedene ingenieurstechnische Aspekte der Proteinadsorption. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die Thermodynamik des Adsorptionsprozesses gelegt. Es wurden sowohl die Interaktionen der Autprotease EDDIE mit Affinitätsliganden als auch die Adsorption verschiedener Modellproteine an hydrophobe Oberflächen untersucht. Des weiteren wurden Sekundär- und Tertiärstruktur unter dem Blickwinkel der großtechnischen Rückfaltung analysiert. Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), dynamische Differenzkalorimetrie (DSC), abgeschwächte Totalreflektions-Fourier-Transformations-Infrarot- (ATR-FTIR) sowie Fluoreszenz-Spektroskopie wurden gemeinsam mit der Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) eingesetzt. Mittels ATR-FTIR gelang es, die Sekundärstruktur von adsorbierten Proteinen in-situ zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, dass gewisse Proteine ihre Konformation bei der Adsorption änderten. Änderungen der Wärmekapazität sowie der Enthalpie bestätigten, dass Konformationsänderungen stattfanden. Zusätzlich zeigte sich, dass die Proteinkonformation in der adsorbierten Schicht mit zunehmender Oberflächenbeladung stabilisiert wurde. Ammoniumsulfat wirkte stabilisierend auf die Proteinstruktur in Lösung, was mittels DSC und SAXS belegt werden konnte. Im Gegensatz dazu entfaltete Ammoniumsulfat eine destabilisierende Wirkung an der fest-flüssig Phasengrenzfläche. Zusätzlich wurden Affinitätsinteraktionen zwischen EDDIE und Peptidliganden unter chaotropen Bedingungen untersucht. Diese Interaktionen wurden für das Auffangen und Reinigen von EDDIE Fusionsproteinen genutzt. Ein entscheidendes Ergebnis war, dass die Immobilisierung des Peptidliganden polyKW den Interaktionsmodus veränderte und die thermodynamische Triebfeder umkehrte. Weitere Unter-suchungen lieferten Erkenntnisse über die beeindruckenden Rückfaltungs- und Spaltungseigenschaften von EDDIE. So zeigte sich beispielsweise, dass diese unabhängig von der Protein-konzentration waren. Ausschließlich die Konzentration des Chaotrops sowie die 1. Aminosäure des Fusionspartners wirkten sich auf die Geschwindigkeit der Spaltungsreaktion aus. Diese Eigenschaft wurde erfolgreich genutzt, um die Reaktions-geschwindigkeit um das fünffache zu steigern. |
| Abstract in Englisch: | This study features several engineering aspects associated with protein adsorption. A special focus was placed on thermodynamics of adsorption. Interaction of the autoprotease EDDIE with affinity ligands as well as adsorption of several model proteins to hydrophobic surfaces were analyzed. EDDIE secondary and tertiary structure were investigated in the context of technical refolding. Isothermal titration calorimetry (ITC), differential scanning calorimetry (DSC), attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR) and fluorescence spectroscopy as well as small angle X-ray scattering (SAXS) were used. With ATR-FTIR protein secondary structure in the adsorbed layer was analyzed in-situ. It was demonstrated that certain proteins underwent conformational changes upon adsorption. Heat capacity and enthalpy changes associated with adsorption corroborated conformational changes. Proteins were stabilized in the adsorbed layer with increasing surface coverage. Interestingly, ammonium sulfate had stabilizing effects in solution which was shown by DSC and SAXS measurements. Conversely, ammonium sulfate had a destabilizing effect at the liquid-solid interface. Furthermore, affinity interactions of EDDIE with peptide ligands under chaotropic conditions were studied. These interactions could be applied for direct capture and purification of EDDIE fusion proteins. Immobilization of the peptide ligand polyKW affected the type of interaction and changed the thermodynamic driving force. EDDIE exhibited certain remarkable features under batch refolding conditions. Refolding and cleavage kinetics and subsequent release of the target peptide were independent from protein concentration. Chaotrope concentration and the nature of the first amino acid of the fusion partner were the rate limiting factors. These features were used to speed up the cleavage reaction by up to five fold. |
| Schlagworte |
| Schlagwörter Deutsch: | Proteinadsorption, Thermodynamik, biochemische Verfahrenstechnik |
| Schlagwörter Englisch: | Protein adsorption, Thermodynamics, biochemical Engineering |
| Sonstiges |
| Signatur: | D-14105 |
| Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H79000 Department für Biotechnologie (DBT) |
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