| AutorIn | | Name: | Dipl.-Ing., Bakk. techn. Jeannine Schneider | Betreuer| Name: | Ao.Univ.Prof. Mag.rer.nat. Dr.nat.techn. Herta Steinkellner | | Herkunftsbetrieb: | | | 1.Beurteilende(r) | | Name: | Assoc. Prof. Dr. Richard Strasser | | Herkunftsbetrieb: | | | 2.Beurteilende(r) | | Name: | Ao.Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Erika Staudacher | | Herkunftsbetrieb: | | | 1. Berater | | Name: | Ao.Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Friedrich Altmann | | Herkunftsbetrieb: | | | 2. Berater | | Name: | Assoc. Prof. Dr. Richard Strasser | | Herkunftsbetrieb: | | | Arbeit | | Typ der Arbeit: | Dissertation | | Sprache der Arbeit: | Englisch | | Titel der Arbeit in Originalsprache: | Expression of recombinant proteins and glycan-engineering in plants | | Titel der Arbeit in deutsch: | Expression rekombinanter Proteine und Modifizierung von Glykanen in Pflanzen | | Titel der Arbeit in englisch: | | | Publikationsmonat: | 02.2014 | | Seitenanzahl: | 161 | | Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur | | AC-Nummer: | AC10775977 | | Abstract | | Abstract in Deutsch: | Rekombinante Proteine gewinnen zunehmend an Bedeutung in der pharmazeutischen Industrie. N-Glykosylierung, das Anheften von Zuckern an Proteine, ist oft wichtig für deren Bioaktivität. Deshalb werden Expressionssysteme für korrekte Glykosylierung benötigt.
Diese Arbeit hatte das Ziel die humane Butyrylcholinesterase (rBChE), ein sogenannter Bioscavenger für Nervengifte, in Pflanzen herzustellen. Dieses Enzym, derzeit aus humanem Serum gewonnen, benötigt für seine physiologische Aktivität sialylierte N-Glykane; solche Strukturen fehlen in Pflanzen jedoch. Mit einem transienten Expressionssystem wurde rBChE in Nicotiana benthamiana Pflanzen erfolgreich exprimiert. Außerdem wurde durch Koexpression mit anderen Glykosylierungsenzymen rBChE, sekretiert in den zellulären Zwischenraum, mit sialylierten Strukturen, ähnlich der humanen BChE, produziert. Diese Veränderung erforderte die gleichzeitige Expression von bis zu acht Säuger-Glykosylierungsenzymen. Im Vergleich zu sekretierter rBChE sind die N-Glykane des aus ganzen Blättern gereinigten Enzyms hauptsächlich oligomannosidisch, typisch für Proteine im endoplasmatischen Retikulum (ER). Konfokale Mikroskopie zeigte tatsächlich eine unerwartete ER-Lokalisierung von rBChE. Alle rBChE Varianten waren biologisch aktiv.
Weiters wurden N. benthamiana Mutanten (STGalT), die stabil mit der humanen β1,4-Galaktosyltransferase (GalT) tranformiert wurden und somit im Menschen vorkommende galaktosylierte Strukturen synthetisieren, biochemisch charakterisiert. Bereits geringe Expression von GalT generiert β1,4-galaktosylierte Strukturen, jedoch verursacht die Überschreitung einer gewissen Enzymaktivität den Phänotyp der Pflanzen.
Die Resultate tragen zu einem besseren Verständnis der Glykosylierungsprozesse in vivo und zur gezielten Darstellung spezifischer Glykosylierungsprofile von rekombinant produzierten Proteinen bei. Die Untersuchungen sind daher sowohl aus grundlagenwissenschaftlicher wie auch angewandter Sicht von Bedeutung. | | Abstract in Englisch: | Recombinant proteins are increasingly being recognized by the pharmaceutical industry.
N-glycosylation, i.e. addition of sugar moieties to the protein backbone, is in many cases important for the bioactivity of a protein. Thus, expression systems allowing proper glycosylation are needed.
Here we pursued the expression of recombinant human butyrylcholinesterase (rBChE), a bioscavenger for nerve agents, in plants. The enzyme, currently obtained from human serum, needs sialylated N-glycans for bioavailability. Such structures are absent in plants. Using a transient expression system rBChE was efficiently produced in the plant species Nicotiana benthamiana. Moreover, upon applying a glycoengineering approach based on in planta co-expression of human glycosylation enzymes, rBChE, secreted to the intercellular space, carrying highly sialylated glycans which largely resembles the serum derived counterpart, was generated. This modification required the simultaneous expression of up to eight mammalian glycosylation enzymes in plants. In contrast to the secreted version, rBChE purified from total leaf extracts carried mainly endoplasmic reticulum (ER) typical oligomannosidic carbohydrates. This is a consequence of aberrant ER localization of rBChE, as determined by live cell imaging. Importantly, all plant-derived rBChE variants were biologically active.
Another part of the Thesis was a biochemical characterization of STGalT-plants, a N. benthamiana glycosylation mutant stably transformed with the human enzyme β1,4-galactosyltransferase (GalT), that synthesize human type galactosylated carbohydrates. It was shown that β1,4-galactosylated structures are already synthesized upon low expression of GalT. However, by exceeding certain threshold levels plants develop a phenotype.
Overall, these results contribute to a better understanding of glycosylation in vivo and the generation of targeted protein glycan-profiles. This research contributes to both basic and applied science.
| | Schlagworte | | Schlagwörter Deutsch: | Biotechnologie, Glykoprotein, Molekulare Biologie der Pflanzen, Proteinexpression, Sialinsäure, Butyrylcholinesterase, Glykoengineering | | Schlagwörter Englisch: | biotechnology, glycoprotein, plant molecular biology, protein expression, sialic acid, butyrylcholinesterase, glycoengineering | | Sonstiges | | Signatur: | D-16785 | | Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H94100 Institut für Angewandte Genetik und Zellbiologie (IAGZ) | |
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